基因型

D(ara-leu)7697 DlacX74 DphoA PvuII phoRaraD139ahpCgalE galK rpsL (DE3) F’[lac+ lacIq pro]gor522::Tn10trxB pRARE2 (CamR, StrR, TetR)

簡(jiǎn)要說(shuō)明

Rosetta-gami 2(DE3) 菌株集合了Rosetta 2和Origami2兩種菌株的優(yōu)點(diǎn)： pRARE2賦予其Rosetta2菌株的優(yōu)點(diǎn)——補(bǔ)充大腸桿菌缺乏的7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA,CUA,CCC,GGA和CGG)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平。gor522::Tn10trxB賦予其Origami2菌株的優(yōu)點(diǎn)——突變的硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase) (trxB)和gu胱甘肽還原酶(glutathione reductase) (gor)基因，它們是還原途徑的兩個(gè)關(guān)鍵酶，其突變有利于高效形成正確折疊的含有二硫鍵的蛋白，增強(qiáng)蛋白的可溶性；同時(shí)該菌株不具有卡na霉素抗性，可用于具有卡na霉素抗性質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶)適合T7啟動(dòng)子誘導(dǎo)的蛋白表達(dá)。Rosetta-gami2(DE3)菌株具有l(wèi)u霉素，lian霉素，四環(huán)素抗性，由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率高達(dá)108 cfu/μg DNA。

操作說(shuō)明

1、Rosetta-gami 2(DE3)菌株感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化，加入目的DNA并用手撥EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘。

2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。 

3.向離心管中加入700 μl不含抗生素的無(wú)菌培養(yǎng)基(2YT或LB)，混勻后37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4.5000 rpm離心一分鐘收菌，留取100 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含所選質(zhì)粒篩選抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。

5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

注意事項(xiàng)

1、感受態(tài)細(xì)胞最好在冰中緩慢融化，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

2.混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。

3.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少最終用于涂板的菌量。

4.誘導(dǎo)時(shí)，IPTG濃度可選（0.1-2 mM均可）。

5.為獲得需要量的蛋白，最佳誘導(dǎo)時(shí)間，溫度，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。